In biologie, soos in eiendom, maak ligging saak. Werkende kopieë van aktiewe gene - genoem boodskapper-RNA's of mRNA's - word strategies deur lewende weefsels geposisioneer, en hul ligging help dikwels om te reguleer hoe selle en weefsels groei en ontwikkel. Maar om baie mRNA's gelyktydig te ontleed, moes wetenskaplikes selle tot 'n pulp maal, wat hulle geen goeie manier gelaat het om vas te stel waar daardie mRNA's in die sel sit nie.
Nou het 'n span by die Wyss Institute of Biologically Inspired Engineering by Harvard University en Harvard Medical School, in samewerking met die Allen Institute for Brain Science, 'n nuwe metode ontwikkel wat wetenskaplikes in staat stel om duisende mRNA's en ander tipes vas te stel. van RNA's gelyktydig in ongeskonde selle - dit alles terwyl die volgorde van letters, of basisse, bepaal word wat hulle identifiseer en openbaar wat hulle doen.
Die metode, genoem fluoresserende in situ RNA-volgordebepaling (FISSEQ), kan lei tot vroeëre kankerdiagnose deur molekulêre veranderinge te openbaar wat kanker in oënskynlik gesonde weefsel aandryf. Dit kan kankermutasies opspoor en hoe hulle reageer op moderne geteikende terapieë, en teikens vir veiliger en doeltreffender te ontbloot.
Die metode kan bioloë ook help om te verstaan hoe weefsels subtiel verander tydens embrioniese ontwikkeling - en selfs help om die doolhof van neurone wat die menslike brein bedraad, te karteer. Die navorsers het die metode in vandag se aanlyn-uitgawe van Science gerapporteer.
"Deur omvattend na geenuitdrukking binne selle te kyk, kan ons nou talle belangrike verskille in komplekse weefsels soos die brein raaksien wat vandag onsigbaar is," het George Church, Ph. D., 'n Kernfakulteitslid by die Wyss gesê. Instituut en professor in genetika aan die Harvard Mediese Skool. “Dit sal ons help om soos nog nooit tevore te verstaan hoe weefsels ontwikkel en funksioneer in gesondheid en siekte nie."
Sluit RNA's in plek
Gesonde menslike selle skakel tipies byna die helfte van hul 20 000 gene op enige gegewe tyd aan, en hulle kies daardie gene versigtig om die verlangde sellulêre reaksies te produseer. Boonop kan selle geenuitdrukking op of af skakel, en aanpas om enige plek van 'n paar werkende kopieë van 'n geen tot 'n paar duisend te produseer.
Maar om terselfdertyd die sellulêre ligging van al daardie mRNA's vas te stel, is 'n groot taak.
Church en Je Hyuk Lee, Ph. D., 'n Navorsingsgenoot by die Wyss Institute en Harvard Medical School, was opgewasse vir die uitdaging. Boonop wou hulle terselfdertyd die volgorde van daardie RNA's bepaal, wat hulle identifiseer en dikwels hul funksie openbaar.
Lee en sy kollegas het die weefsel eers chemies behandel om die sel se duisende RNA's in plek te stel. Toe het hulle ensieme gebruik om daardie RNA's na DNA-replikas te kopieer, en daardie replikas baie keer te kopieer om 'n klein bolletjie replika-DNS te skep wat op dieselfde plek vasgemaak is.
Hulle het daarin geslaag om duisende van die sel se RNA's gelyktydig reg te maak en te repliseer - maar het toe 'n slagoffer van hul eie sukses geword. Die RNA's was so styf in die sel gepak dat selfs 'n bedrieglike mikroskoop en kamera nie die flikkerligte van een individuele bal replika DNA van dié van sy bure kon onderskei nie.
'n Nuwe manier om RNA te beeld
Om daardie probleem op te los, het die navorsers 'n onkonvensionele metode begin om klein voorwerpe binne selle te visualiseer. Dit werk soos 'n stedelike posstelsel. As 'n posmeester probeer het om elke huis in haar stad volgens kleur te identifiseer, sou sy vinnig sonder kleure opraak soos nuwe huise gebou is, wat lei tot onafgelewerde pos. Posmeesters hou eerder boek van elke huis deur 'n unieke adres daaraan toe te ken.
Die navorsers het besef hulle kan aan elke RNA in die sel 'n unieke adres toeken: die volgorde van "letters", of basisse, in die RNA-molekule self. En hulle het gereken dat hulle die adres kon lees deur metodes te gebruik wat soortgelyk is aan die volgende generasie DNA-volgordebepaling, 'n stel hoëspoed genoomvolgordebepalingsmetodes wat Kerk in die vroeë 2000's help ontwikkel het.
In volgende-gen-volgordebepaling maal wetenskaplikes weefsel op, onttrek sy DNS, breek die DNS in stukke, en verdun dan daardie stukke genoeg sodat elke stukkie DNS op 'n aparte plek op 'n glasskyfie vassit. Hulle gebruik ensieme en vier verskillende fluoresserende kleurstowwe - een elk vir elk van die vier "letters," of basisse - om die DNA 'n reeks kleure te laat flits wat die volgorde daarvan openbaar.
Deur analogie het die wetenskaplikes probeer om RNA in plek in die sel vas te maak, 'n klein balletjie te maak met baie ooreenstemmende DNA-replikas van elke RNA, en dan volgende-gen DNA-volgorde aan te pas sodat dit in vaste selle werk. Die vier flitsende kleure sal die basisvolgorde van elke replika-DNS openbaar, wat hulle die basisvolgorde van die ooreenstemmende RNA sal vertel waaruit dit afgelei is. En daardie rye sou in teorie 'n onbeperkte aantal unieke adresse verskaf - een vir elk van die oorspronklike RNA's.
Die wetenskaplikes het eers gesukkel om die flitsende ligte van individuele balle replika-DNS te visualiseer vanaf 'n afstand waar die hele landskap van die weefsel in sig gebly het.
Hulle het daarin geslaag deur net 'n fraksie van daardie flikkerende kolletjies op enige gegewe tyd selektief aan te skakel, sodat hulle enkele balle replika-DNS kon onderskei wat oor die sellulêre landskap flits.
Die strategie sal egter net werk as hulle werklik genoeg van die basisreeks kan lees om 'n unieke adres te verskaf. Hulle kon eers nie meer as ses basisse in die replika-DNS bepaal nie, wat nie genoeg unieke adresse verskaf het om individuele gene in die menslike genoom te identifiseer nie. Dit is toe dat Evan Daugharthy, 'n gegradueerde student aan die Harvard Mediese Skool, ingetree het.
FISSEQ by die werk
Daugharthy het eers 'n algoritme bedink om die volgorde van die replika-DNS met die bekende volgorde van gene in die menslike genoom op te spoor. Flitsende ligte wat nie met 'n regte geen ooreenstem nie, is van die beeld uitgevee.
Toe het Daugharthy 'n kommersiële DNS-volgordebepalingstel gekap, wat die span in staat gestel het om 30 basisse te volgorde, meer as genoeg om elke replika DNS van 'n unieke adres te voorsien. Op hierdie manier kon die span 'n saamgestelde beeld skep wat die volgorde, en ligging, van RNA verteenwoordig wat ooreenstem met elke geen in die menslike genoom.
Lee, Daugharthy en hul kollegas het toe die metode getoets om die gene op te spoor wat velselle aanskakel soos hulle vermeerder en migreer om 'n gesimuleerde wond in 'n petriskottel te genees. Selle wat in die wond gegroei het, het 12 gene gehad wat baie meer of baie minder geaktiveer is as nabygeleë selle wat ledig op die kantlyn gesit het. Soortgelyke eksperimente kan nuwe merkers van siek weefsel of nuwe teikens vir geteikende molekulêre terapieë identifiseer.
"Wat George se span bereik het, is 'n tegnologiese kragtoer," het Wyss Institute-stigterdirekteur, Don Ingber, M. D., Ph. D. "Deur ongelooflike subtiele maar ongelooflik belangrike veranderinge in geenuitdrukking raak te sien en hul posisie in die sel presies te definieer, het hulle gehelp om die deur oop te maak vir 'n nuwe era van sellulêre diagnostiek."
